隨著高效液相色諧的快速發(fā)展，各種新的色譜技術(shù)不斷涌現(xiàn)。其中，反相高效液相色譜因其良好的選擇性，應(yīng)用的范圍不斷擴(kuò)大，顯示出很好的應(yīng)用前景。
反相高效液相色譜是化學(xué)鍵合相色譜法的一種?；瘜W(xué)鍵合相色譜法是由液液色譜法發(fā)展起米的，是為了解決在分離過程中，機(jī)械吸附在載體上的固體液的流失問題而發(fā)展出來的一-種新方法。 鍵合相色譜法通過將不同的有機(jī)官能團(tuán)通過化學(xué)反應(yīng)共價(jià)鍵合到硅膠載體表面的游離羥基上，而生成化學(xué)鍵合固定相。化學(xué)鍵合周定相對(duì)各種極性溶劑都有良好的化學(xué)穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性。由它制備的色譜主柱效高、使用壽命長、重現(xiàn)性好，兒乎對(duì)各種類型的有機(jī)化合物都呈現(xiàn)良好的選擇性，并可用于梯度洗脫操作，消除了分配色譜法的缺點(diǎn)。
根據(jù)鍵合固定相和流動(dòng)相相對(duì)極性的強(qiáng)弱，可將鍵合色譜法分為正相鍵合色譜法和反相鍵合色譜法。反相鍵合色譜法即反相高效液相色譜。在正相鍵合色譜法中，鍵合固定相的極性大于流動(dòng)相的極性，適用于分離油溶性或水溶性的極性和強(qiáng)極性化合物。在反相鍵合相色謂法中，鍵合固定相的極性小于流動(dòng)相的極性，適用于分離非極性、極性或離子型化合物，其應(yīng)用范圍也比正相鍵合相色譜法更廣泛。
在反相健合相色請法中伸用的是非極性鍵合固定相。它是將全多孔(或薄光)微粒硅膠載體，經(jīng)酸活化處理后與含羥基鏈或苯基的硅烷化試劑反應(yīng)，生成表面具有烷基或苯基的非極性固定相。如共價(jià)結(jié)合到載體上的直鏈碳?xì)浠衔镎粱取?/span>
關(guān)于反相色譜的分離機(jī)理，吸附色譜的作用制認(rèn)為溶質(zhì)在固定相上的保留主要是疏水作用，在高效液相色譜中義被稱為疏溶劑作用。根據(jù)疏溶劑理論，當(dāng)溶質(zhì)分子進(jìn)入極性流動(dòng)相后，即占據(jù)流動(dòng)相中相應(yīng)的空間，而排擠一部分溶劑分子。當(dāng)溶質(zhì)分子被流動(dòng)相推動(dòng)與因定相接觸時(shí)，溶質(zhì)分子的非極性部分或非極性因子會(huì)將非極性固定相上附著的溶劑膜排擠開，而直接與非極性同定相上的烷基官能團(tuán)相結(jié)合(吸附)形成締合絡(luò)合物，構(gòu)成單分子吸附層。這種疏溶劑的吸附作用是可逆的，當(dāng)流動(dòng)相極性減少時(shí)，這種疏溶劑斥力下降，會(huì)發(fā)生解締，并將溶質(zhì)分子解放而被洗脫下米。
反相色譜中疏水性越強(qiáng)的化合物越容易從流動(dòng)相中擠出去，在色譜柱中滯留時(shí)間也長，所以反相色譜法中不同的化合物根據(jù)它們的疏水特性得到分離。反相色譜法適于分離帶有不同疏水基團(tuán)的化合物，亦即非極性基團(tuán)的化合物。此外，反相色譜法可用于分離帶有不同極性基團(tuán)的化合物?？梢酝ㄟ^改變流動(dòng)相的溶劑及其組成和pH，以影響溶質(zhì)分子與流動(dòng)相的相互作用，改變它們的滯留行為。另外，反相色譜中水的流動(dòng)相中占的比例伸縮性很大，可以從0-100%，從而使反相色譜可用于水溶性、脂溶性化合物的分離。反相色諧法中的固定相是被共價(jià)結(jié)合到硅膠載體上的直鏈飽和烷烴，其鏈的長短不同，長的是十八烷基，這也是使用得多的固定相。直鏈飽和烷烴疏水特性隨著碳?xì)滏湹拈L度而增加，在反相色譜柱中溶質(zhì)由于疏水作用而滯留的時(shí)間也將隨著碳?xì)滏湹拈L度而增加。在一般情況下這意味著用碳?xì)滏滈L的反相色諧柱能得到較好的分辨率，在多數(shù)情況下是依靠反復(fù)試驗(yàn)選擇色譜柱。由丁反相色譜法的固定相是疏水的碳?xì)浠衔?，溶質(zhì)與固定相之間的作用主要是非極性相互作用，或者說疏水相互作用，因此溶劑的強(qiáng)度隨著極性降低而增加。
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